Resumen Introducción: Tuberculosis (TBC) sigue siendo la segunda causa de muerte por una enfermedad infecto-contagiosa después del síndrome de inmunodeficiencia humana adquirida (SIDA). Actualmente, el escenario de técnicas y metodologías de laboratorio para la identificación y drogo-sensibilidad está cambiando gradualmente. Se han recomendado e introducido ensayos rápidos basados en la amplificación de ácidos nucleicos (NAAT's) que se desarrollan mediante la reacción de polimerasa en cadena (RPC). Bajo este principio, se destaca spoligotyping –una herramienta de genotipificación y epidemiología molecular en TBC– estandarizada a partir de aislados bacterianos, que permite el estudio del genoma de Mycobacterium mediante la amplificación de 43 secuencias cortas no repetitivas, localizadas en la región de repetición directa (RD1). Objetivo: Evaluación de spoligotyping a partir de baciloscopías, como una opción independiente de cultivo, para la caracterización de Mycobacterium tuberculosis a partir de muestras de esputo en pacientes del Instituto Nacional Cardiopulmonar de Tegucigalpa, Honduras. Método: De 37 pacientes con cultivo (y baciloscopía) positivos para M. tuberculosis, se obtuvieron 50 muestras de expectoración. Se realizó estudio microbiológico y molecular en muestras respiratorias conteniendo ADN de micobacterias, a partir de baciloscopías, concentrados y cultivo, para la identificación y análisis genotípico a través de la técnica de spoligotyping. Resultados: El spoligotyping fue positivo en 37/37 de muestras de cultivo positivo (S: 100%), en 36/37 (S: 97,3%) de muestras con baciloscopía positiva y en 6/10 (S: 60%) de muestras de concentrado de esputo. La intensidad de la baciloscopía positiva tuvo una relación directa con la sensibilidad de spoligotyping. Discusión: El fusionar el potencial de una herramienta útil en epidemiología molecular para analizar muestras de ADN proveniente de baciloscopías, visualiza una plataforma diagnóstica y genotípica para países en vías de desarrollo como una alternativa innovadora y altamente sensible en la hibridación de oligonucleótidos específicos a partir material genético en baciloscopías (P+, P++, P+++), pero requiere mejorar la concordancia entre patrones genéticos obtenidos, comparables con el uso estandarizado de aislados de cepas de M. tuberculosis.